Uso del subtítulo de imágenes moteadas

Sep 24, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 2613 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

El crecimiento de la colonia microbiana está impulsado por la actividad de las células ubicadas en los bordes de la colonia. Sin embargo, este proceso no es visible a menos que se realice una tinción específica o un corte transversal de la colonia. La tecnología de imágenes moteadas es un método no invasivo que permite la visualización de las zonas de mayor actividad microbiana dentro de la colonia. En este estudio, se utilizó la técnica de imágenes con moteado láser para registrar el crecimiento de las colonias microbianas. Este método se probó en tres microorganismos diferentes: Vibrio natriegens, Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Los resultados mostraron que el sistema de análisis de moteado no sólo es capaz de registrar el crecimiento de la colonia microbiana sino también de visualizar la actividad de crecimiento microbiano en diferentes partes de la colonia. La técnica de imágenes moteadas desarrollada visualiza la zona de "mayor actividad microbiana" que migra desde el centro a la periferia de la colonia. Los resultados confirman la precisión de los modelos anteriores de crecimiento de colonias y proporcionan algoritmos para el análisis de la actividad microbiana dentro de la colonia.

El crecimiento del tamaño de las colonias se utiliza como criterio para caracterizar la actividad microbiana en medios de agar. El crecimiento del tamaño de las colonias generalmente se monitorea grabando imágenes en vivo en diferentes momentos y comparando los tamaños de las colonias. Al adoptar esta técnica de imágenes, las imágenes se obtienen mediante cámaras de alta resolución o escáneres de superficie plana1,2. El tiempo crítico de detección, el tamaño de la colonia, la tasa de crecimiento y el tamaño máximo de la colonia son los parámetros que pueden cuantificarse utilizando los métodos de imágenes en vivo existentes.

Existen varios modelos que describen el crecimiento de las colonias3,4,5. En muchos modelos, se describe que el crecimiento de las colonias microbianas es desigual: el crecimiento de las colonias depende de las zonas activas de los microbios que, a su vez, dependen del suministro de nutrientes del medio. Por ejemplo, el crecimiento microbiano en el borde de la colonia es más activo que en su centro debido al suministro constante de nutrientes de los medios circundantes o al empuje constante de las células sobre los laterales. La estructura microscópica de la colonia respalda muchas de estas suposiciones. Las células en el centro de la colonia de levaduras dejan de proliferar y pierden viabilidad mientras que las células en el borde de la misma colonia están vivas y continúan creciendo (proliferando)6. Las diferencias en la actividad microbiana en diferentes partes de la colonia no se pueden visualizar con precisión con los métodos de imágenes en vivo existentes. Actualmente, las diferentes actividades microbianas dentro de las colonias solo se pueden explorar con procedimientos invasivos: corte transversal de colonias y tinción de viabilidad6.

Un patrón de interferencia creado por la luz coherente reflejada o dispersada desde diferentes partes de la superficie iluminada es una mancha láser. Si un objeto irradiado con motas de láser no cambia las propiedades de dispersión con el tiempo, la imagen de motas tampoco cambiará. Si los dispersores se mueven espontáneamente (p. ej., movimiento browniano), algunas motas comienzan a cambiar (forma, intensidad). El cambio en las propiedades de dispersión de los objetos crea una mancha que varía en el tiempo. Es decir, eventos o influencias externas, así como procesos que ocurren directamente en la superficie medida, pueden provocar cambios en las imágenes moteadas7. Con respecto a este fenómeno, la técnica de imágenes de moteado láser ha demostrado ser útil para monitorear la actividad microbiana en medios ópticamente no homogéneos mediante el análisis de patrones de moteado láser que varían en el tiempo.

La técnica de imágenes con moteado láser es una tecnología emergente para análisis médicos y de seguridad alimentaria. Permite la detección temprana del crecimiento microbiano8, la identificación de infecciones fúngicas en manzanas9 y la medición del flujo sanguíneo periférico en pacientes con esclerosis10.

En este estudio, se utilizó la técnica de imágenes moteadas para registrar el crecimiento y las características estructurales de la colonia microbiana. Los resultados mostraron que el sistema de análisis de moteado desarrollado es capaz no sólo de registrar el crecimiento de una colonia microbiana sino también de visualizar la actividad de crecimiento microbiano en las diferentes partes de la colonia. Las imágenes moteadas revelan que el crecimiento de la colonia está impulsado por la proliferación celular en sus bordes y no en su centro. Los resultados confirman la precisión de los modelos anteriores de crecimiento de colonias y proporcionan algoritmos para análisis de actividad microbiana dentro de la colonia.

En los experimentos se utilizaron las siguientes cepas microbianas: Escherichia coli ATCC® 8739 (E. coli), Vibrio natriegens DSM 759 (V. natriegens) y Staphylococcus aureus ATCC® 6538P (S. aureus). Los cultivos bacterianos se mantuvieron en placas de agar. E. coli y S. aureus se mantuvieron en medio agar LB que consistía en Bacto Peptone 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, agar 20 g/l (todos Biolife, Italia) y NaCl 5 g/l (Sigma, Alemania). V. natriegens se mantuvo a temperatura ambiente en caldo de sal NB agarizado: Difco Nutrient Broth 8 g/l, NaCl 15 g/l, como lo sugieren Weinstock et al.11.

Todas las especies microbianas se subcultivaron a partir de una sola colonia en los respectivos medios líquidos y se cultivaron a + 30 °C durante la noche. Se inocularon placas de Petri con cultivos bacterianos diluidos en serie para producir entre 20 y 200 colonias por placa. Se colocaron placas de Petri con bacterias inoculadas a + 30 °C en una incubadora (Herracell 240-i, Thermo Scientific). El crecimiento de las colonias se controló en paralelo mediante iluminación láser de 635 nm (consulte la descripción en "Sistema experimental para capturar imágenes moteadas con láser e imágenes bajo iluminación de banda ancha") y mediante un escáner de documentos de superficie plana (CanoScan 4400f, Canon). El escaneo automatizado de placas después de cada intervalo de 15 o 30 minutos se garantizó ejecutando la aplicación Auto Clicker. La resolución de las imágenes fue de 600 DPI.

El sistema experimental de imágenes de moteado láser se ensambló para capturar imágenes a escala macro bajo luz LED blanca e iluminación láser roja. El sistema consta de una fuente láser multimodo, una fuente de luz LED blanca, una lente con montura C de 35 mm @F18, un atenuador óptico, una placa de agar de prueba (con bacterias inoculadas) y una cámara CMOS (Fig. 1). Las motas láser se generaron mediante un láser de estado sólido bombeado por diodo multimodo de 635 nm polarizado linealmente (potencia de salida de hasta 300 mW) con una longitud de coherencia de 30 cm. El atenuador óptico se utilizó para lograr la exposición óptima para la captura de imágenes y evitar los efectos de calentamiento de la placa iluminada, lo que permitió una densidad de potencia de 3 a 5 mW/cm2 de la luz láser dispersa en toda la superficie de la placa de agar. El diámetro del rayo láser en la superficie era superior a 9 cm, lo que proporcionaba una iluminación uniforme de toda la placa de Petri estándar. Los componentes principales del sistema se presentan en la Fig. 1. Las imágenes moteadas fueron capturadas por una cámara CMOS a intervalos de 30 s para experimentos con diferentes duraciones (25 a 70 h). El tiempo de exposición se fijó en 1 s; Se eligió según la iluminación láser y el diafragma de la lente. Los parámetros de la configuración óptica, incluida la resolución de la cámara, el diafragma de la lente, la distancia de la cámara a la placa de Petri y la región de interés resultante, se eligieron para lograr una resolución espacial adecuada para detectar motas de láser. El aumento de la lente se fijó en 0,2. Se eligió el valor de diafragma de F18 como el equilibrio óptimo entre la nitidez de la imagen, el tamaño de las manchas y la exposición requerida. Esto resulta en una resolución espacial de 9 μm y un tamaño de mota de 33 μm.

Flujo de trabajo experimental para la captura de imágenes moteadas durante el crecimiento de bacterias. (A) Inoculación de una sola colonia en un medio LB y cultivo durante la noche (+ 30 °C). (B) Dilución e inoculación de cultivo nocturno en medio LB agarizado. (C) Crecimiento de colonias en placas de agar en termostato + 30 °C con captura de imágenes moteadas con láser de 635 nm y escáner de superficie plana. D Procesamiento de imágenes y análisis de datos (entorno MATLAB): detección de tamaño de colonia, velocidad de crecimiento, filtración de señal de speckle, identificación de migración de speckle, etc.

En estudios anteriores, los autores describieron un análisis de subpíxeles de correlación sensible, que puede ayudar a detectar la actividad bacteriana y sus efectos dentro de una colonia8,12. Todo el campo del experimento (placa de Petri) se dividió en pequeñas secciones de N × N píxeles. Los pasos siguientes se realizaron para cada sección por separado. Se realizó una correlación cruzada normalizada bidimensional entre imágenes consecutivas de N × N píxeles desde el principio hasta el final del experimento13:

donde a(x,y) y b(x,y) son dos cuadros adyacentes en la secuencia, \(\overline{a}\) y \(\overline{b}\) son los valores promedio de estos dos cuadros, u y v son desplazamientos espaciales entre los fotogramas a(x,y) y b(x,y) hacia xey, respectivamente.

Era necesario descubrir el desplazamiento exacto del pico de correlación cruzada. Este valor caracteriza los cambios que ocurren entre imágenes consecutivas de NxN píxeles:

Para encontrar un valor más preciso del desplazamiento, se realizó la interpolación parabólica alrededor del pico de la función de correlación cruzada14:

donde \({a}_{u}\) y \({b}_{u}\) son los coeficientes parabólicos.

Los desplazamientos obtenidos entre cada par de imágenes de NxN píxeles adyacentes se acumularon desde el inicio hasta el final del experimento:

La ejecución del algoritmo descrito para imágenes consecutivas de N × N píxeles para toda la secuencia crea una "señal de tiempo".

Este algoritmo se implementó para todas las secciones de N × N píxeles en todo el campo del experimento. Así, en lugar del campo del experimento considerado, se obtuvo una matriz bidimensional de las "señales de tiempo", donde el tiempo es la tercera dimensión.

Para encontrar los extremos locales y evitar la influencia de picos transitorios locales, es conveniente suavizar la señal15. Se utilizó la función de envolvente de señal (Fig. 2). Para este propósito se puede utilizar una técnica de raíz cuadrática media móvil u otro algoritmo similar:

donde N es la longitud de la ventana, n es la muestra actual, k es el índice que se ejecuta dentro de la ventana. En consecuencia, N (la longitud de la ventana) es responsable del grado de suavizado de la señal. Para evitar valores atípicos al realizar la técnica RMS, los valores extremos pueden truncarse, como se hace adoptando la técnica de la media truncada16.

Arriba a la izquierda: la señal obtenida mediante el algoritmo (azul) y su envolvente (roja). (Señal del centro de la colonia). La línea verde indica el momento de máxima actividad. La figura muestra una señal de una colonia de S. aureus. También se observó un patrón de señal de moteado similar para E. coli y V. natriegens. Abajo a la izquierda: un espectrograma es una representación de una señal en un dominio de tiempo-frecuencia utilizando una transformada de Fourier de corto tiempo (STFT), que permite observar simultáneamente el comportamiento de la señal y el ruido en el tiempo y la frecuencia. Lado derecho: el ruido (fuera de la colonia) obtenido mediante el algoritmo (arriba) y el espectrograma de ruido (abajo).

En la Fig. 2, también es posible comparar la señal (dentro de la colonia) y el ruido (fuera de la colonia) tanto en el dominio del tiempo como de la frecuencia. La señal es mucho más alta que el nivel de ruido.

En primer lugar, se probó si el sistema de imágenes láser moteado establecido no afectaba el crecimiento de las colonias microbianas. Para verificar esto, el radio de crecimiento de la colonia estimado por el sistema de moteado láser se comparó con los resultados obtenidos utilizando el método de referencia: un reconocido sistema de imágenes de escáner de superficie plana. Para este propósito, se subcultivaron microorganismos de una sola colonia durante la noche, se diluyeron en serie y luego se inocularon en una placa de Petri para observar la formación de colonias a partir de una sola célula (aproximadamente 20 a 200 colonias por placa) o aplicando manchas de diluciones en serie en la placas y obteniendo así macrocolonias. Se cultivaron micro y macrocolonias en un medio de agar en la misma incubadora en paralelo bajo un sistema de imágenes moteadas y en el escáner de superficie plana (Canon Canoscan4400r). Se registró el crecimiento de las colonias de V. Natriegens, E. coli y S. aureus, y sus patrones de motas se analizaron utilizando un algoritmo de correlación de subpíxeles (descrito en "Algoritmo de conversión de imágenes motas en señales de tiempo"). Los resultados se presentan en la Fig. 3.

Dinámica del radio de crecimiento de las colonias a lo largo del tiempo. Los radios de las colonias de E. coli, V. natriegens y S. aureus se midieron mediante análisis de imágenes moteadas con láser (azul) o considerando imágenes tomadas con un escáner de superficie plana (Canon 4400, 600 DPI) (rojo).

Comparando el crecimiento de las colonias probadas, se obtuvieron resultados muy similares con ambos sistemas. Por lo tanto, se puede concluir que el sistema de moteado láser establecido no afecta el crecimiento de colonias microbianas (ver Fig. 3). Comparamos la tasa de crecimiento radial de las colonias microbianas cultivadas bajo un dispositivo de imágenes moteadas y dentro de un escáner de superficie plana, y la tasa de crecimiento radial no difirió significativamente (prueba t, p > 0,05), consulte la Tabla complementaria 1.

Además, se analizó si la señal moteada de la colonia en crecimiento se correlaciona con el número de células de la colonia. El tiempo del valor máximo de la señal de las imágenes moteadas con láser se comparó con el número de células inicial dentro de la macrocolonia (ver Fig. 4). El tiempo del valor máximo de la señal se define como el momento en que la actividad de la señal alcanza su máximo. El cultivo de E. coli durante la noche se diluyó en serie y se inoculó en medio de agar LB como macrocolonias (el volumen de cada inóculo fue de 5 μl). El crecimiento de las macrocolonias se registró utilizando un sistema de imágenes láser moteado. El tiempo del valor máximo de señal para cada macrocolonia se determinó y se representó frente al número de células inicial por macrocolonia. Se calcularon los valores medios del tiempo pico de la señal y la desviación estándar de las tres series de inoculación independientes (ver Fig. 4).

Dependencia del tiempo del valor máximo de la señal (líneas rojas en el gráfico de la izquierda y círculos azules en el gráfico de la derecha) obtenido por el sistema de imágenes láser del número inicial de células de E. coli en la colonia.

Los primeros resultados demostraron que el crecimiento de colonias dentro de un sistema de imágenes moteadas era el mismo que en un escáner de superficie plana. Ligeras diferencias entre ellos surgen del crecimiento individual de la colonia, que puede verse afectado por la localización de la colonia dentro de la placa o la distancia a los vecinos más cercanos17. Mientras tanto, el tiempo del valor máximo de la señal moteada depende del número de células inicial dentro de la colonia. Si el número inicial de células en la colonia es grande, se requiere menos tiempo para alcanzar la señal moteada máxima. Por otro lado, si el número inicial de celdas es pequeño, tardará más en alcanzar el valor máximo de la señal moteada. Aunque el crecimiento de la colonia continúa durante más de 20 h (ver Fig. 4 para E. coli), el máximo de la señal moteada se alcanza una vez y nunca se “recupera”.

La señal obtenida por correlación de subpíxeles de imágenes moteadas con láser, que caracteriza la actividad bacteriana, aumentó dentro de la colonia, alcanzó su máximo y luego disminuyó. La intensidad de la señal tuvo una distribución espaciotemporal notable. Diferentes partes de la colonia tenían diferentes tiempos máximos de señal. El pico máximo de actividad se observó inicialmente en el centro de la colonia. Con el tiempo, la "ola" de actividad migró desde el centro hacia los bordes de la colonia (ver Figs. 5 y 6). Este comportamiento espaciotemporal de la señal moteada se observó en todas las colonias microbianas analizadas: S. aureus, E. coli y V. natriegens. Aunque se realizaron análisis en profundidad sobre la estructura de la migración de la señal moteada en varias colonias de tres especies microbianas diferentes (V. natriegens, E. coli y S. aureus), la migración de la señal desde el centro hacia el borde de la colonia es característica de todas y cada una de las colonias microbianas. En la figura complementaria S1 se muestra un ejemplo de parte de una placa de Petri con aproximadamente 25 a 30 colonias. Cada una de las colonias después del análisis de correlación de subpíxeles muestra la formación del efecto de anillo de actividad descrito anteriormente.

Distribución espaciotemporal de la señal moteada en la colonia de S. aureus. Fila superior: dinámica de la señal a lo largo del tiempo en diferentes puntos dentro de la colonia (estrella blanca en los gráficos del medio). La línea verde marca la actividad máxima, después de la cual la señal disminuye. Fila del medio: cambios en la actividad durante el crecimiento de la colonia. Fila inferior: imágenes moteadas sin procesar.

El momento de máxima actividad de la colonia (el inicio de la disminución de la actividad) durante el crecimiento de la colonia de S. aureus. Imagen superior: una imagen espaciotemporal bidimensional; Imagen inferior: la actividad máxima en función del tiempo. También se observó un comportamiento espaciotemporal similar de la señal dentro de colonias de E. coli y V. natriegens.

Es posible obtener una imagen que ilustre el inicio de la disminución de la actividad en toda la colonia (ver Fig. 6, imagen superior) eligiendo los momentos del inicio de la disminución en toda el área de la colonia y colocándolos en un Mapa espacial bidimensional con las coordenadas correspondientes.

El “anillo” de alta actividad se forma alrededor del centro y luego migra junto con el frente de la colonia en crecimiento. El color muestra el momento (en horas) en que la actividad comenzó a disminuir: el color azul (en el centro) representa lo más temprano, el color rojo representa lo más tarde (el borde de la colonia).

La ubicación de la primera disminución en el mapa se puede asumir como el punto de partida para el crecimiento de una colonia microbiana. Conociendo las coordenadas de este punto de partida o centro, es posible obtener una curva del crecimiento de la colonia en función del tiempo. Sin embargo, dado que el crecimiento de la colonia depende de varios factores (la disponibilidad de oxígeno y nutrientes, el movimiento browniano, el empuje y/o la atracción de las células vecinas dentro de la colonia, la asincronía del crecimiento y la proliferación celular dentro de la colonia, etc.) la curva resultante tendrá una cierta dispersión de valores (Fig. 6, gráfico inferior). Por lo tanto, se aplicó un filtro de mediana móvil para suavizar los datos de la curva15:

donde N es la longitud de la ventana, n es la muestra actual. La mediana es el número que se sitúa en el medio de un conjunto de números cuando se ordenan en orden ascendente. Es decir, la mitad de los elementos del conjunto de números no son menores que la mediana y la otra mitad no son mayores que la mediana:

Este método se aplicó por las siguientes razones: (1) No intenta ajustar la curva a una forma específica: una línea recta, una parábola, etc. (2) A diferencia de una media móvil, no tiene en cuenta los valores atípicos. .

El efecto "anillo" se obtuvo para los tres tipos de bacterias analizadas. La tasa de crecimiento fue la principal diferencia que se observó (Fig. 7).

Curvas de actividad máxima de las colonias en función del tiempo para 3 a 4 colonias de V. natriegens (azul), E. coli (rojo) y S. aureus (verde).

Tomando los puntos correspondientes a la distancia al centro de la colonia según la curva descrita en las Figs. 6 y 7, se obtienen las coordenadas en el espacio (x, y) para cada “anillo”. En cada uno de esos puntos del espacio se coloca una función envolvente suavizada de la señal (Fig. 5). Así, muchas señales corresponderán a cada radio específico (la distancia desde el centro de la colonia hasta el punto de máxima actividad). En una situación ideal, todas las señales dentro del mismo “anillo” (a la misma distancia del centro de la colonia) serían iguales. Sin embargo, el crecimiento de una colonia bacteriana se ve afectado por varias condiciones mencionadas anteriormente, por lo que estas señales son ligeramente diferentes. Por lo tanto, es necesario promediar todas las señales para un radio determinado, de modo que cada radio reciba una señal que lo caracterice. Dicho promedio se realizó adoptando el método de promedio truncado16, donde el truncamiento no se realizó en amplitud, sino en el momento del pico de actividad:

donde L es el número de señales envolventes a una distancia determinada, \({k}_{b}\) y \({k}_{f}\): el número de señales envolventes que se truncaron desde cada lado. Es decir, no se tuvieron en cuenta aquellas señales cuyo pico de actividad en el radio dado difería mucho de la tendencia general (prematura o retrasada). Las señales promediadas obtenidas se mapearon en función de la distancia desde el centro y el tiempo (Fig. 8, imagen superior).

Envolventes de las señales promediadas en función de la distancia desde el centro de la colonia y el tiempo (arriba) y el pico de actividad en función de la distancia desde el centro de la colonia para diferentes momentos (abajo) de S. aureus. También se observó un comportamiento espaciotemporal similar de la señal dentro de colonias de E. coli y V. natriegens.

Seleccionando varios puntos en el tiempo en el mapa, es posible observar cómo se verá el pico de actividad en función de la distancia desde el centro de la colonia. El ancho del pico es proporcional al ancho del “anillo” de actividad, y su cambio en el tiempo se muestra en el gráfico inferior de la Fig. 8.

El ancho espacial de la señal en diferentes momentos se puede observar en la Fig. 8. El ancho de la señal corresponde a la disminución desde el valor máximo hasta un cierto valor. Si no hubiera ruido, ni señales no deseadas, ni ningún otro factor, el criterio sería sencillo: reducir el nivel de la señal o su potencia desde el valor máximo a cero. Sin embargo, en condiciones reales, debería haber algún umbral en el que la señal aún se pueda distinguir del ruido. Se eligió como criterio la disminución de la potencia de la señal desde el máximo a 1/3 del valor máximo. Es decir, cabe señalar que el ancho real es ligeramente mayor que el recibido. Es posible encontrar el ancho para cada momento. Este ancho coincidirá con el ancho del “anillo” en el momento correspondiente (ver Fig. 9).

Determinación del ancho del “anillo” de actividad para la colonia de S. aureus: (a) valores de señal y ancho determinado del anillo de actividad (línea morada), (b) el ancho obtenido del “anillo” de actividad, (c ) comparación del ancho obtenido del “anillo” de actividad (líneas negras) para una colonia en diferentes momentos. También se observó un comportamiento espaciotemporal similar de la señal dentro de colonias de E. coli y V. natriegens.

En las Fig. 9a,b se puede observar que aunque el cambio en el ancho del anillo es pequeño, puede considerarse constante con algunas desviaciones. Es decir, desde el momento en que fue posible comenzar a observar el "anillo" y hasta el final de la observación, cuando el "anillo" desapareció, el ancho del "anillo" se mantuvo aproximadamente sin cambios (con reservas sobre la precisión de la medición , fenómenos aleatorios en el comportamiento de una colonia de muchos microorganismos, ruido, etc.). El comportamiento descrito para una colonia seleccionada se observó para todos los tipos de bacterias consideradas en este estudio. El ancho del “anillo” es diferente para cada tipo de bacteria. La Figura 10 muestra el ancho del "anillo" para todos los tipos de colonias bacterianas. Los resultados obtenidos corresponden al modelo matemático de crecimiento de colonias microbianas introducido por John Pirt (“modelo Pirt”)5.

La amplitud del “anillo” de actividad en función del tiempo para diferentes colonias bacterianas; (a) ancho del “anillo” de actividad determinado por el método de moteado; (b) ancho del “anillo” calculado utilizando el modelo de Pirt (Ec. 9). Los parámetros: alfa yr para el modelo también se obtienen a partir de experimentos de moteado. Cada curva demuestra el ancho del “anillo” de actividad a lo largo del tiempo de una colonia de un tipo de bacteria específico.

El estudio Pirt5 proporciona una fórmula para calcular la anchura de la zona activa o “anillo”:

donde ω es el ancho de la zona de proliferación celular activa de la colonia, r es el radio de la colonia en el momento t y \({r}_{0}\) es el radio en t = 0; α es la tasa de crecimiento específica también conocida como (μ, h−1), que se puede encontrar a partir de la ecuación de Gompertz8,17. Así, teniendo los datos experimentales (el radio de crecimiento de la colonia, el tiempo correspondiente y μ), es posible calcular el ancho de la zona activa o el ancho del “anillo” usando la Ec. (9). Los resultados obtenidos en este estudio y el modelo Pirt se comparan en la Fig. 10.

El patrón general del ancho del anillo es único y uniforme para cada especie bacteriana. Sin embargo, la dinámica del ancho del anillo de actividad de cada colonia de una especie microbiana podría cambiar con el tiempo. Para colonias de crecimiento más largo, la proliferación y, por tanto, la actividad moteada de la colonia conserva su actividad por más tiempo. Se puede suponer que esto está relacionado con la distribución de las colonias en la placa. Dado que las colonias bacterianas en las placas de agar se distribuyeron aleatoriamente, su crecimiento se vio afectado por las colonias microbianas vecinas. El crecimiento de las colonias microbianas se ve fuertemente afectado por las colonias vecinas en las proximidades, por lo que cuantas más colonias vecinas tenga una colonia determinada, antes cesa su crecimiento debido al agotamiento de los recursos nutricionales comunes de los medios18,19.

El modelo de Pirt predice que el borde en crecimiento activo de la colonia microbiana podría tener un ancho similar al medido por la actividad moteada (compárese con la Fig. 10. V. natriegens a y b), mientras que sobreestima el ancho del borde activo de la colonia microbiana. colonia microbiana en el caso de E. coli y S. aureus. Se puede implicar que las diferencias se derivan del hecho de que la tasa de crecimiento α, h−1 en la ecuación de Pirt es una constante, mientras que en realidad cambia (disminuye) durante el crecimiento de la colonia4. Otro aspecto a considerar es que en ambos casos se utilizaron datos experimentales para los cálculos. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, el ruido ha influido en la precisión de las mediciones.

El crecimiento de colonias microbianas en medios de agar es una técnica utilizada en microbiología en investigaciones y pruebas de rutina para analizar la contaminación microbiana de muestras ambientales, alimentarias o médicas. Se utilizan muchos modelos matemáticos para describir el crecimiento de colonias microbianas4,5,18,20. El ancho de la zona de actividad más externa (“el anillo” de la colonia) a menudo se incluye en los modelos matemáticos para simplificar (linealizar) el cálculo de la dinámica de crecimiento de la colonia5,21. Sin embargo, los datos experimentales sobre el tamaño real de la zona de actividad de la colonia en crecimiento son escasos.

El modelo Pirt de crecimiento de colonias microbianas se encuentra entre los primeros que describen el crecimiento radial de colonias microbianas a lo largo del tiempo. El modelo se alinea bien con las observaciones reales si no hay inhibición del crecimiento por parte de las colonias vecinas y el tamaño de la zona de actividad en el borde es constante. El modelo de Pirt ha sido validado en macrocolonias de crecimiento distante que surgen de muchas células5. Sin embargo, en pruebas rutinarias de muestras ambientales o médicas, normalmente se observan microcolonias que crecen a una distancia aleatoria de las colonias vecinas22. Además, debido a la composición genómica o fisiológica de las especies microbianas, sus colonias crecen en diferentes formas 3D (en forma de cúpula, planas, etc.), lo que a su vez podría influir en el ancho de la zona de actividad en el borde de la colonia23 .

En uno de los modelos recientes sugeridos por Warren et al.24, la orientación de las células microbianas (horizontal o vertical) junto con el agotamiento gradual de nutrientes alrededor de la colonia definen la dinámica del crecimiento de la colonia. Warren y sus colegas en sus simulaciones notaron la formación de una estructura de “anillo” metabólicamente activa alrededor de la colonia, que está formada por células que tienen contacto directo con el sustrato, y donde tiene lugar la mayor actividad de proliferación24.

En este (nuestro) estudio, se desarrolló un sistema basado en moteado láser para registrar el crecimiento de colonias microbianas junto con un algoritmo de análisis de correlación de subpíxeles de imágenes de moteado láser, que permite discriminar y cuantificar zonas de actividad dentro de la colonia. La señal moteada tiene buena correlación con la tasa de crecimiento de la colonia y depende del número de células por colonia (ver Figs. 3 y 4).

Se observa cierta dispersión de los parámetros registrados mediante imágenes de speckle (ancho del anillo de actividad, distancia máxima de migración desde el centro, curvas de crecimiento de colonias microbianas), lo que podría atribuirse a los cambios en las propiedades del medio de agar, la variabilidad biológica de la muestra y/o o exactitud de las mediciones.

Se sabe que las placas de agar tienden a perder agua (secarse) durante el cultivo microbiano25. La formación y la fuerza de la señal moteada podrían verse afectadas por el secado del medio de agar. Según nuestras observaciones, en muchos experimentos en las primeras 3 a 5 h, pueden ocurrir efectos asociados con el secado del medio de agar. Sin embargo: (1) Este efecto se extendió por toda la placa de Petri como una "ola" y luego desapareció sin causar efectos adicionales. (2) El efecto observado de "secado" se produjo mucho antes que la formación de "anillos". En consecuencia, incluso si apareciera secado, este efecto no afectó a la formación de anillos. En la Fig. 11 se muestra un ejemplo del efecto de secado. Además, Sandle et al. observaron una mayor pérdida de peso al comienzo (0–4 h) del cultivo que al final.

Imágenes moteadas del agar secado (medio de agar sin bacterias) en una placa de Petri.

El crecimiento de las colonias en el medio de agar fue similar después de la inoculación: las colonias tienden a tener la misma tasa de crecimiento inicial (ver Fig. 3) y su crecimiento divergió entre sí más adelante: las colonias dejaron de crecer en diferentes momentos. Dado que la asignación de las colonias en la placa fue aleatoria, con un número variable de colonias vecinas, el agotamiento de los recursos y, posteriormente, el cese del crecimiento de cada colonia podría ocurrir en diferentes momentos. Sin embargo, cada colonia exhibió un anillo de actividad con una migración característica fuera del centro y un cese con el tiempo cuando el crecimiento activo disminuye (ver Fig. 12).

La señal del anillo de actividad cesa con el tiempo en las colonias envejecidas de Vibrio natriegens. Arriba: imágenes de colonias moteadas, Abajo: imagen después de aplicar el algoritmo de correlación de subpíxeles, anillo de cese de actividad.

Cuando una colonia ha dejado de estar activa, todavía es visible en las imágenes moteadas sin procesar (Fig. 12 (arriba)) pero deja de demostrar un efecto de anillo (Fig. 12 (abajo)). Así, se concluye que los "anillos" no son fenómenos aleatorios relacionados con la desecación del agar, ni artefactos del borde de la colonia, sino una señal de actividad microbiana, que desaparecería cuando la colonia dejara de crecer.

La técnica de speckle propuesta permite identificar y registrar la dinámica del ancho de la zona de actividad a lo largo del crecimiento de la micro y macro colonia. En el futuro, el registro del crecimiento de las colonias mediante láser speckle podría convertirse en una herramienta atractiva y no invasiva para cuantificar la dinámica del crecimiento y la actividad de proliferación con resolución de subcolonias.

El método de imágenes moteadas proporciona más información sobre la actividad microbiana dentro de las colonias que las series de imágenes estándar bajo luz blanca.

Se ha demostrado que la técnica de imágenes con moteado láser es un método verdaderamente no invasivo, que permite monitorear el crecimiento ininterrumpido de colonias microbianas (la tasa de crecimiento de las colonias bajo el sistema de moteado fue estadísticamente indistinguible del crecimiento microbiano en condiciones de referencia). Después de aplicar el algoritmo de correlación de subpíxeles ("Algoritmo de conversión de imágenes moteadas en señales de tiempo"), el tiempo máximo de aparición de la señal moteada fue proporcional al número de células en la colonia (Fig. 4).

El análisis sensible de subpíxeles de correlación reveló que existen zonas de actividad distintas dentro de la colonia que migran desde el centro hacia los bordes durante el crecimiento de la colonia. Observamos un patrón similar de migración de la zona de actividad ("anillo") en las colonias de tres especies microbianas diferentes. Además, observamos la presencia del anillo en cada colonia en crecimiento activo (ver Figura complementaria S1). La velocidad de migración del "anillo" varió entre las diferentes especies microbianas y, por lo tanto, reflejó sus diferentes tasas de crecimiento típicas de cada una de estas especies.

Las imágenes moteadas son una tecnología potente y prometedora que, por primera vez, ha ayudado a visualizar zonas de actividad dentro de la colonia microbiana. Anteriormente la presencia de estas zonas se predecía matemáticamente. El estudio actual también sugiere formas potenciales de seguir desarrollando la tecnología de imágenes de motas para estudios de colonias microbianas: aumentar la sensibilidad de los sistemas ópticos y electrónicos para la detección de motas, minimizar el ruido y buscar opciones para multiplexar la tecnología. Permitiría registrar la actividad de proliferación microbiana lo antes posible, así como detectar colonias de crecimiento lento e identificar la actividad microbiana dentro de la colonia, lo que hace que la técnica propuesta sea adecuada para muchas aplicaciones directas en investigación y desarrollo, medicina y epidemiología.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Levin-Reisman, I., Fridman, O. y Balaban, NQ ScanLag: Cuantificación de alto rendimiento del crecimiento de colonias y el tiempo de retraso. J. Vis. Exp. 89, e51456 (2014).

Google Académico

Takeuchi, R. y col. Colony-live: un método de alto rendimiento para medir la cinética de crecimiento de colonias microbianas. Revela diversos efectos de crecimiento de la desactivación de genes en Escherichia coli. BMC Microbiol. 14, 171 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Zwietering, MH, Jongenburger, I., Rombouts, FM y van't Riet, K.,. Modelado de la curva de crecimiento bacteriano. Aplica. Reinar. Microbiol. 56(6), 1875–1881 (1990).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rivas, EM et al. Un modelo matemático simple que describe el crecimiento del área y el número de células totales y viables en las colonias de levadura. Letón. Aplica. Microbiol. 59(6), 594–603 (2014).

Artículo PubMed Google Scholar

Pirt, SJ Un estudio cinético del modo de crecimiento de colonias superficiales de bacterias y hongos. J. Gen. Microbiol. 47(2), 181–197 (1967).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Váchová, L., Cáp, M. & Palková, Z. Colonias de levaduras: un modelo para estudios de envejecimiento, adaptación ambiental y longevidad. Óxido. Medicina. Celúla. Longev. 2012, 601836 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Goodman, JW Fenómenos moteados en óptica. Teoría y aplicación (Englewood, 2007).

Balmages, I. et al. Imágenes láser moteadas para la detección temprana de unidades formadoras de colonias microbianas. Biomédica. Optar. Expreso 12(3), 1609–1620 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Pieczywek, P. y col. Detección temprana de infección por hongos en manzanas almacenadas con sensores ópticos: comparación de biomoteado, imágenes hiperespectrales y fluorescencia de clorofila. Control de alimentos 85, 327–338 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Cutolo, M. et al. ¿Es el análisis de contraste moteado con láser (LASCA) el nuevo chico de la cuadra en la esclerosis sistémica? Una revisión sistemática de la literatura y un estudio piloto para evaluar la confiabilidad de LASCA para medir la perfusión de sangre periférica en pacientes con esclerodermia. Autoinmune. Rev.17(8), 775–780 (2018).

Artículo PubMed Google Scholar

Weinstock, MT, Hesek, ED, Wilson, CM y Gibson, DG Vibrio natriegens como huésped de rápido crecimiento para la biología molecular. Nat. Métodos 13(10), 849–851 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Balmages, I., Bliznuks, D., Liepins, J., Zolins, S. y Lihachev, A. Análisis de correlación de series temporales de moteado láser para la detección de actividad bacteriana. Proc. SPIE 11359, 113591D (2020).

Google Académico

Gåsvik, KJ Metrología óptica 3ª ed. (Wiley, 2002).

Reservar Google Académico

Lai, X. & Torp, H. Métodos de interpolación para la estimación del retardo de tiempo utilizando el método de correlación cruzada para la medición de la velocidad de la sangre. Traducción IEEE. Ultrasonido. Ferroeléctrico. Frec. Control 46(2), 277–290 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tukey, JW Métodos no lineales (no superponibles) para suavizar datos. Proc. Estafa. Rec. EASCON. 673 (1974).

Lehmann, EL Teoría de la estimación puntual (Wiley, 1983).

Libro MATEMÁTICAS Google Scholar

Balmages, I. et al. Evaluación de los parámetros de crecimiento de colonias microbianas mediante imágenes moteadas con láser. Proc. SPIE 12144, 121440B (2022).

Google Académico

Chacón, JM, Möbius, W. & Harcombe, WR La ​​base espacial y metabólica de la variación del tamaño de las colonias. ISME J. 12(3), 669–680 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Cooper, AL, Dean, AC y Hinshelwood, C. Factores que afectan el crecimiento de colonias bacterianas en placas de agar. Proc. R. Soc. Londres. B. Biol. Ciencia. 171 (1023), 175-199 (1968).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Kreft, JU, Booth, G. & Wimpenny, J. BacSim, un simulador para el modelado individual del crecimiento de colonias bacterianas. Microbiología (Lectura). 144 (parte 12), 3275–3287 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Panikov, NS Crecimiento microbiano heterogéneo. En Cinética del crecimiento microbiano, 238–251 (Chapman y Hall, 1995).

Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S. & Thierry, A. Colonias bacterianas en medios sólidos y alimentos: una revisión sobre su crecimiento e interacciones con el microambiente. Frente. Microbiol. 6, 1284 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Wimpenny, JW El crecimiento y la forma de colonias bacterianas. J. Gen. Microbiol. 114(2), 483–486 (1979).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Warren, MR y cols. Establecimiento espaciotemporal de densas colonias bacterianas que crecen en agar duro. Elife 8, e41093 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Sandle, T. Exposición de la placa de sedimentación bajo flujo de aire unidireccional y el efecto de la pérdida de peso sobre el crecimiento microbiano. EUR. J. Parenter. Farmacéutica. Ciencia. 20(2), 45–50 (2015).

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Esta investigación está financiada por el proyecto FEDER “Sistema basado en aprendizaje automático rápido y rentable para el análisis del crecimiento de microorganismos” (acuerdo nº 1.1.1.1/19/A/147).

Facultad de Ciencias de la Computación y Tecnología de la Información, Departamento de Control de Computadores y Redes de Computadores, Universidad Técnica de Riga, Zunda Krastmala 10, LV-1048, Riga, Letonia

Ilya Balmages y Dmitrijs Bliznuks

Laboratorija Auctoritas Ltd, Čiekurkalna 1. linija 11, Riga, LV-1026, Letonia

Ilya Balmages, Ernests Tomas Auzins y Edgars Baranovics

Instituto de Microbiología y Biotecnología, Universidad de Letonia, Jelgavas str. 1, Riga, LV-1004, Letonia

Janis Liepins y Ernests Tomas Auzins

Instituto de Física Atómica y Espectroscopia, Universidad de Letonia, Jelgavas str. 3, Riga, LV-1004, Letonia

Ilze Lihacova y Alexey Lihachev

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Correspondencia a Ilya Balmages.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Balmages, I., Liepins, J., Auzins, ET et al. Uso del análisis de correlación de subpíxeles de imágenes moteadas para revelar un mecanismo de crecimiento de colonias microbianas. Informe científico 13, 2613 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29809-0

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Recibido: 29 de agosto de 2022

Aceptado: 10 de febrero de 2023

Publicado: 14 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29809-0

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